东汉末年至十六国时期，中国北方陷入无休止的战乱中，生活在河西走廊、关中平原地区的1万多户汉族士民为躲避战乱而辗转迁徙到高昌地区，由此推动了当地经济、文化的快速发展。

并推动高昌垒成为吐鲁番盆地的经济中心、西域最为丰腴之地。高昌开始被周边各股政治势力所关注。

前凉时委任的戊己校尉赵贞趁乱在高昌垒拥兵割据称雄，意图独霸西域。后来前凉国王张骏派兵攻占高昌垒，废除戊己校尉旧制，设置地方政权组织高昌郡。

后来，高昌郡先后隶属于前秦、后凉、西凉、北凉4个政权，其辖境相当于今新疆维吾尔自治区吐鲁番盆地东部哈拉和卓以东一带。高昌城也在原有基础上进行了扩建，开始成为一个名副其实的城市、高昌地区的政治中心。

5世纪以后，中国内地进入南北朝对峙时期，中原各个政权均无暇顾及西域地区。

北魏时高昌地区的汉族大姓阚氏首领阚爽在柔然支持下占据高昌城，自任高昌太守，宣布脱离北凉的统治，割据一方。

后来匈奴人沮渠无讳率北凉政权残部攻占高昌城，改元承平，号称凉王，高昌首次成为地方割据政权，史称北凉沮渠高昌王朝。

460年，柔然汗国攻灭北凉沮渠政权后，拥立阚伯周为高昌王。此后，在高昌地区以高昌城为都城，先后建立了阚氏高昌王国、张氏高昌王国、马氏高昌王国、麴氏高昌王国等4个汉人政权。

其国土面积最大时东近敦煌，南接河南罗布泊以南的吐谷浑国境，西次龟兹，北邻敕勒。

隋朝建立后，麴氏高昌王国开始奉中原王朝为正统，并派遣使臣向隋朝遣使朝贡，并参加了隋炀帝东征高句丽的战役。而后，隋炀帝册封麴伯雅为光禄大夫、弁国公、高昌王，并下嫁华容公主宇文玉波作王后。

唐朝建立后，高昌国王麴文泰入朝觐见唐高祖、唐太宗，其再娶妻子宇文玉波被赐姓李氏，并改封常乐公主。

随着西突厥汗国的兴起，高昌王国开始在大唐帝国和西突厥汗国之间采取骑墙政策。

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640年，高昌国王麴文泰向西突厥乙毗咄陆可汗称臣结盟，截断了丝绸之路，攻打唐朝属国伊吾，扣押西域诸国经高昌前往唐朝通好的商人和贡使。

鉴于此，唐太宗派吏部尚书侯君集率10万大军攻灭麴氏高昌王国。

自此高昌地区重新纳入中原王朝管辖后，且由此打通了唐朝与西域、中亚交往的通道。

唐朝政府在此置西昌州，归安西都护府管辖，州治设在高昌城，其城市的政治与军事职能空前膨胀。

同时，在西昌州实行与内地相同的政治、军事、经济及文化制度，推行均田制和租庸调制等一系列政治、经济措施，大力发展当地的农业和手工业，并确保丝路贸易的畅通，使当地经济、文化发展进入了历史上的繁荣昌盛时期，高昌城也得到进一步扩建，成为内地通往西域的重要门户，连接中原与中亚、西亚和欧洲的交通枢纽，世界古代宗教最活跃、最发达的地方，常住居民近5万人。

唐末年，游牧在天山北麓的回鹘人大首领仆固俊率部攻占高昌城。次年，他以高昌城为都城，建立了高昌回鹘王国。其疆界最盛时西至龟兹、阿克苏、乌什一带，与喀喇汗王朝接壤，西北界天山，北面包括准噶尔盆地，南隔塔里木盆地与于阗为邻，东至敦煌与西夏分界，东南以阿尔金山与黄头回纥接壤。